DNA与RNA尝试甄别步骤应结合样品处置、核酸酶消化、凝胶电泳和扩增了局判断。单看色彩、吸光度或电泳条带容易受到浓度、传染物和样品齐全性的影响。较稳妥的做法是将统一样品分成平行组 ，别离进行DNase处置、RNase处置 ，并凭据前提增长逆转录PCR验证 ，最后综合观察样品是否被特异性降解以及能否直接扩增。
先凭据尝试前提选择甄别路线
若是尝试室只有分光光度计和凝胶电泳设备 ，能够选取“吸光度初筛＋核酸酶处置＋琼脂糖凝胶”的路线。若是具备PCR仪和逆转录前提 ，建议在此基础上增长RT-PCR ，由于它能从职能上分辨“直接存在的DNA”和“必要先逆转录成cDNA的RNA”。
- 急剧初筛：测定A260、A280和A260/A230 ，相识样品是否含有核酸及是否存在显著传染。
- 重要甄别：将样品别离与DNase和RNase反映 ，再比力处置前后的电泳条带变动。
- 了局确认：对统一靶标进行通常PCR和逆转录PCR ，并设置不加逆转录酶的对照。
正式尝试前应筹备已知DNA、已知RNA和无模板空缺对照。未知样品出现的变动只有与对照比力 ，才有明确诠释。
步骤一：用DNase和RNase进行平行消化
核酸酶消化是最直接的甄别步骤之一。DNase重要作用于DNA ，RNase重要作用于RNA ，因而能够通过样品在处置前后的齐全性变动判断其重要成分。
- 将未知样品等量分装为至少四组：未经处置组、DNase处置组、RNase处置组和必要的缓冲液对照组。各组尽量维持一样体积、浓度和反映功夫。
- 依照所用试剂说明书参与DNase或RNase ，并使用相匹配的反映缓冲液。分歧酶的盐浓度、金属离子要求和失活前提可能分歧 ，不能直接套用统一套前提。
- 反映实现后进行酶失活或纯化 ，预防残留酶、盐分缓和冲液影清脆续电泳或扩增。
- 将各组样品在一样上样量或一样核酸量下进行凝胶电泳 ，比力条带、拖尾和信号强度。
若是样品重要是DNA ，DNase处置后原有高分子条带或拖尾通 ；嵯灾跞跎踔烈没 ，而RNase处置影响较幼。若是样品重要是RNA ，RNase处置后信号通常显著降落 ；DNase处置后仍应保留重要RNA信号。必要把稳的是 ，常用RNase A对单链RNA较有效 ，对双链RNA或某些特殊结构RNA的消化成效可能不齐全 ，因而“RNase处置后没有齐全隐没”不能单独证明样品不是RNA。
步骤二：通过凝胶电泳观察核酸特点
琼脂糖凝胶可能显示核酸的大幼散布和齐全性 ，但电泳图像更适合与核酸酶了局共同使用 ，不宜单独作为DNA或RNA的最终判断凭据。
齐全的基因组DNA通常阐发为靠近加样孔的大分子条带 ，或者在高分子区域形成较集中的信号。DNA产生剪切后 ，可能出现向下延长的拖尾。总RNA的图谱与起源有关 ，真核细胞总RNA常出现较显著的核糖体RNA条带 ；RNA降解后则常阐发为弥散性加强、低分子区域信号增长。
分歧样品的结构、长度和浓度差距很大 ，质粒DNA、PCR产品、幼RNA和降解RNA的迁徙阐发并不一样。RNA齐全性分析通常必要相宜的变性电泳系统 ，不然二级结构可能扭转迁徙快率。电泳时还应设置DNA或RNA尺度品 ，维持胶浓度、缓冲液、上样量和电压前提一致。
步骤三：用通常PCR和RT-PCR确认
若是未知样品含有某个已知靶标 ，PCR与RT-PCR的组合是较有说服力简直认方式。DNA能够直接作为PCR模板 ；RNA则通常必要先通过逆转录天生cDNA ，再进行PCR扩增。
- 从统一样品中分出两份。一份直接进行通常PCR ，另一份先进行逆转录 ，再进行PCR。
- 同时设置RT阳性组和RT阴性组。RT阴性组不参与逆转录酶 ，用于判断样品中是否存在可直接扩增的DNA传染。
- 使用一样的PCR引物、循环前提和电泳检测方式比力各组了局。
| 通常PCR | RT-PCR | 可能注明 |
|---|---|---|
| 阳性 | 阳性 | 样品可能同时含有DNA和RNA ，或RNA样品中存在DNA传染 |
| 阴性 | 阳性 | 更切合RNA模板经逆转录后产生cDNA的情况 |
| 阳性 | 阴性 | 更切合DNA模板 ，或逆转录、RNA保留环节存在问题 |
| RT阴性组也阳性 | RT阳性组阳性 | 应优先排查DNA传染 ，不能直接判定为RNA特异扩增 |
引物设计会影响判断。若要甄别RNA起源 ，优先选择跨表显子衔接位点的引物 ，或使用可能分辨基因组DNA与转录本的设计。若样品自身不含指标序列 ，PCR阴性并不能证明样品没有DNA或RNA ，只能注明该靶标未被检测到。
步骤四：吸光度和显色反映只能作为辅助
核酸在260 nm左近有吸收峰 ，可用于估算浓度。常见经验值是纯DNA的A260/A280约为1.8 ，纯RNA约为2.0 ，但这只是近似领域。蛋白质、酚、盐、胍类试剂和低浓度样品城市扭转比值。A260/A230偏低也提醒可能存在有机物或盐类残留。吸光度适合判断浓度和纯化质量 ，不适合单独证明样品是DNA还是RNA。
传统的二苯胺反映可对DNA中的脱氧核糖产生显色 ，地衣酚类反映可用于RNA有关的核糖显色。这类化学步骤能够作为讲授演示或初筛 ，但容易受到试剂纯度、加热前提、样品浓度和其他糖类物质的影响 ，部门试剂还拥有侵蚀性或刺激性。进行此类尝试时应使用现成尝试规划 ，在透风和幼我防护前提下操作 ，并将了局与核酸酶消化或电泳了局交叉验证。
推荐的尺度操作组合
对于必要写入尝试纪录或尝试汇报的甄别 ，建议选取以下组合 ，而不是只依赖一种景象：
- 纪录样品起源、保留前提、表观和初始浓度。
- 用统一样品分装未经处置、DNase处置和RNase处置三组。
- 实现核酸酶反映和必要的纯化后 ，进行同前提凝胶电泳。
- 若有明确靶标 ，再设置通常PCR、RT-PCR和RT阴性对照。
- 将电泳图、吸光度、核酸酶敏感性和扩增了局放在一路诠释。
例如 ，样品在DNase处置后显著隐没、RNase处置后根基保留 ，且可能直接进行PCR扩增 ，通常支吃熹重要为DNA。若样品对RNase敏赣注通常PCR阴性而RT-PCR阳性 ，并且RT阴性对照没有扩增 ，则更支吃熹重要为RNA。若两种核酸酶都能造成显著影响 ，或两类扩增均为阳性 ，应试虑DNA与RNA混合、样品降解、酶反映不充分或交叉传染。
常见误判与纪录沉点
样品浓度过低时 ，电泳钟装看不到条带”不蹬宗没有核酸 ；样品降解时 ，DNA也可能出现类似RNA的拖尾。RNase传染会导致RNA在处置前就降解 ，反复冻融也会降低RNA齐全性。进行RNA尝试时 ，应使用无RNA酶耗材 ，缩短室温露出功夫 ，并依照试剂要求保留样品。
尝试纪录中应写明样品分组、酶名称、反映前提、纯化方式、凝胶前提、对照了局及扩增判定凭据。最终结论宜使用“重要成分切合DNA”“了局支持RNA存在”或“提醒混合样品”等表述 ，预防仅凭一个吸光度比值或一条电泳条带作出绝对判断。
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